José de Felippe Junior
Sandro Percário

        Abstract : Atherosclerosis is the number 1 killer in western societies . Last decade , a free radical mechanism for the physiopathology of this disease   was proposed, in which free radicals act as important mediators of cholesterol deposition in peripherical tissues . Besides , metal ions play a decisive role in free radical production in the metal catalyzed Haber-Weiss reaction . This way , we performed the present study to verify the effect of metal ion chelator EDTA in preventing atherosclerotic plaque formation in cholesterol-fed rabbits . The male New Zealand rabbits were divided in fourgroups as follows : group 1(N=7) were fed a normal rabbit chow for tem weeks; group 2(N=9) were fed a 1.5% cholesterol enriched rabbit chow for tem weeks , group 3(N=10) were fed the same atherogenic diet wilst receiveing EDTA (50mg/kg; 3 x week ; subcutaneous ) for the period of tem weeks, group 4(N=8) also received the atherogenic diet wilst receiveing EDTA (50mg/kg; 3 x week ; subcutaneous ) associated with magnesium sulfate (16,6 mg/kg; 3x week; subcutaneous ) for the period of tem weeks. At the end of this period , blood samples were drawn for total cholesterol, triglicerides , HDL-cholesterol, and TBA  reactive species (TBARS) dosage. The animals were then sacrificed and the aorta arteries were removed for atherosclerotic plaque evaluation . The results showed no differences between groups 2,3 and 4 in any of the parameter studied althought there were significative differences between group 1 and the others . Data suggest that free radical may play a crucial role in plaque formation and that metal ions should not be the major souce for free radicals in this animal model.

Introdução 

                        A aterosclerose representa a doença com maior índice de mortalidade , sobretudo nos grandes centros urbanos dos países ocidentais . O infarto agudo do miocárdio , o acidente vascular cerebral , a insuficiência vascular crônica e inúmeras outras patologias são , comprovadamente , decorrentes  da aterosclerose , fato que evidencia o grau de importância desta doença no contexto médico atual(1).
                        A sociedade científica em muito tem se empenhado no estudo dos fatores causadores da aterosclerose , bem como nos métodos preventivos e eficientes para o seu controle. Sobretudo nos últimos 40 anos evidenciaram-se os fatores de risco da doença , que foram classificados em dois grandes grupos os primérios e os secundários . Agrupam-se , deste modo , a hipercolesterolemia , a hipertensão arterial e o fumo como fatores primários . Entre os fatores secundários destacam-se o diabetes , a vida gordura saturada e o “ estresse” (2-4).
                        Na  patogenia da doença aterosclerótica é relevante o papel desempenhado pelas lipoproteínas de baixa densidade (LDL) na formação das placas de ateroma.
                        Recentemente , as lipoproteínas de baixa densidade têm sido descritas como um grupo heterogêneo de partículas que diferem entre si em tamanha , conformação , carga elétrica e composição química . Desta forma tornou-se necessária a  melhor caracterização dos subtipos de LDLs, resultando na subclassificação das LDLs , na qual aparecem como principais categorias as LDLs acetiladas , as metiladas e sobretudo , as peroxidadas . Sobre as  ações  fisiopatológicas das LDLs modificadas ainda existe muita controvérsia , porém atribui-se uma ação mais aterogênica que a LDL nativa (4-6, 10-12,).
                        Mais recentemente , observou-se que os radicais livres participam como importantes intermediários na formação do quadro aterosclerótico (5-11).
                        De acordo com evidências científicas (6-7), a participação dos radicais livres na doença aterosclerótica ocorre através do fenômeno conhecido como “estresse oxidativo ’’ , no qual estas espécies químicas lesam compostos orgânicos e componentes celulares , destacando-se entre eles a membrana da célula endotelial . Assim  , o endotélio fica mais permeável às partículas presentes no sangue e entre elas as LDL ( Low Density Lipoproteins ) , partículas carregadas de colesterol, que poderão ser captadas no espaço subendotelial pelos macrófagos , transformando-os em células com grande conteúdo lipídico, as chamadas “FOAM CELLS ”.
                        Ao  mesmo tempo , na luz do vaso , partículas de LDL nativas , transformam-se em partículas de LDL peroxidadas , pela ação dos radicais livres , sendo mais facilmente reconhecidas pelos receptores de LDL presentes na superfície das células endoteliais e dos macrófagos . Disto decorre um aumento da velocidade de captação de colesterol por estas células , implicando no aumento da velocidade de formação das placas de ateroma.
                        Por outro lado, os macrófagos presentes no espaço subendotelial são capazes de sintetizar e secretar diversos tipos de radicais livres , tais como o radical superóxido , peridril, hidroxila, oxigênio “singlet” e o peróxido de hidrogênio (H2O2)  , espécie química considerada como uma das ERTO. Assim, não somente são capazes de reconhecer mais facilmente as LDL modificadas como também de modificar as LDL nativas que se encontrem no espaço subendotelial .
                        Em nosso laboratório demonstramos anteriormente o efeito benéfico de um antioxidante na regressão de placas e relacioná-lo com uma menor geração de radicais livres . Neste experimento utilizamos o probucol ( varredor do radical livre hidroxila ), em coelhos submetidos a indução dietética de aterosclerose e verificamos que embora não houvesse redução da colesterolemia dos animais , ocorria diminuição da área de lesões ateroscleróticas da artéria aorta , em associação a redução dos níveis plasmáticos de malondialdeído , indicador bioquímico indireto de radicais livres (8,12).
                        Estes terríveis radicais são principalmente representados pelo radical hidroxila , formado durante a reação de Haber-Weiss (Fig. 1 ) , que é catalizada por metais de transição , como  o ferro , alumínio , chumbo e mercúrio . Assim a quelação e conseqüente retirada destes metais do meio intersticial , pode se estabelecer em uma estratégia antioxidante , impedindo a propagação dos fenômenos de peroxidação lipídica . Com o objetivo de testar o potencial efeito do ácido etileno diamino tetracético (EDTA) na inibição da peroxidação lipídica , estudamos a utilização da duas formas terapêuticas do EDTA em coelhos submetidos à indução da aterosclerose por ingestão de dieta rica em colesterol.

    0..                                   transition metais

O 2  +   H2O2                                      OH º .. +  OH-   +  O2

Fig 1 ) A reação de Haber-Weiss.

Material e método

                        Foram utilizados 44 coelhos machos , adultos jovens de raça Nova Zelândia , pesando 2,5 ± 0,5 kg de peso corporal . Os animais foram divididos em quatro grupos , como segue:
                        Grupo A: sete animais ;
                        Grupo B: nove animais;
                        Grupo C: dez animais;
                        Grupo D: oito animais;
                        Os animais dos grupos B,C e D foram submetidos à indução da aterosclerose por ingestão de dieta rica em colesterol pelo período de dez semanas . Simultaneamente à indução da aterosclerose , os animais do grupo C foram tratados com EDTA (50mg/kg; 3x semana ; via subcutânea ), enquanto que os animais do grupo D foram tratados com EDTA (25mg/kg ; 3 x semana ; via subcutânea ), associado ao sulfato de magnésio ( 16,6mg/kg; 3 x dia ; via subcutânea). Paralelamente , os animais do grupo A receberam apenas ração normal para coelho pelo mesmo período .

Preparo da ração rica em colesterol

                        A ração rica em  colesterol é preparada pela vaporização de uma solução de colesterol em clorofórmio sobre a ração , na proporção de 1,5 g de colesterol para 100g de ração . Antes de ser consumida , a ração assim preparada permanece em repouso por 48 horas em uma capela para que o solvente possa evaporar completamente . Após o preparo , a ração é separada em porções individuais de 150g para uso diário e colocada em saco plástico lacrado. Todos os dias pela manhã recolheu-se a sobra de ração do dia anterior , que foi pesada para controle da ingesta de colesterol por animal ( 13-14 ).

EDTA e EDTA -Magnésio

                        O EDTA foi dissolvido em água destilada , na concentração de 1,5 % . Foi administrado aos animais do grupo C na proporção de 50 mg de EDTA para cada quilograma de peso corporal dos animais , 3 vezes por semana , pela via subcutânea . O EDTA – Magnésio foi preparado pela mistura da solução de EDTA 1,5% a uma solução de sulfato de magnésio (1:1; v:v). Esta  solução foi administrada aos animais do grupo D como descrito anteriormente , na proporção de 25 mg de EDTA e 16,6 mg de sulfato magnésio por kilograma de peso corporal dos animais . Tanto o EDTA , como o EDTA - Magnésio foram administrados pelo período de dez semanas .

Parâmetros avaliados

                        Ao final do período de dez semanas foram colhidas amostras de sangue para avaliação laboratorial de colesterol total , HDL-colesterol , LDL-colesterol , triglicérides e malondialdeído. Em sequência os animais foram sacrificados , retirando-se a artéria aorta , desde a emergência do arco aórtico até a bifurcação das ilíacas , e os animais serão sacrificados , sendo colhida nova amostra de sangue , além de retirada a aorta para avaliação da área ocupada por lesões ateroscleróticas e estudo histológico das placas de ateroma (16-17)

Colesterol Total e Frações – O colesterol total foi avaliado por método enzimático – colorimétrico realizado com a utilização de kits comerciais ( Biodiagnóstica ). O HDL-colesterol foi separado pelo método de precipitação com sulfato de dextran, sendo dosado pelo mesmo método descrito para o colesterol total . O LDL – colesterol foi calculado matematicamente pela equação de Friedwald .

Triglicerídeos – Avaliados por método enzimático realizado com a utilização de kits comerciais ( Biodiagnóstica ).

Malondialdeido (MDA)- É um indicador do processo de peroxidação lipídica , processo mediado por radicais livres. O MDA reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) para formar um complexo com absorvência máxima a 532 nm . O método utilizado foi o método descrito por Satoh , modificado ( 15-18).

Porção de artéria coberta por placas ateromatosas : - Medida por planimetria coputadorizada . Este método se baseia na comparação da área da artéria tomada por placas de ateroma em relação à área total da artéria , sendo os dados obtidos em mesa digitalizadora de computador .
 

Resultados

A tabela  contém os valores médios de colesterol total, MDA e porcentagem de artéria aorta coberta por lesões ateroscleróticas , enquanto que a tabela 2 contém os valores médios de triglicérides ,  HDL –colesterol  e LDL - colesterol. OS grupos B , C e D comportaram-se de maneira similiar e, em comparação ao grupo A, demonstraram valores significativamente maiores de colesterol total (p
<0,001), MDA (p<0,001), porcentagem de artéria aorta coberta por lesões ateroscleróticas (p<0,001)e LDL – colesterol (p<0,001).
            Paralelamente estes grupos demonstraram uma significativa diminuição nos valores de HDL – colesterol (p<0,05).

Discussão

            No presente estudo a ingestão de dieta rica em colesterol foi eficiente na indução de doença aterosclerótica neste modelo animal , bem como no aumento dos níveis séricos de colesterol total, LDL – colesterol e MDA , além de promover a diminuição dos níveis séricos de HDL – colesterol .
            No entanto, embora os radicais livres possam participar de maneira efetiva nos fenômenos fisiopatológicos que dão origem à aterosclerose , o uso de terapia de quelação de íons metálicos não preveniu o aparecimento da doença . Tal fato pode ser explicado pela inespecificidade de ligação do EDTA , o qual pode causar depleção de importantes minerais essenciais como o selênio e o zinco , dentre outros. Além disto , o balanço entre os íons cálcio e os íons magnésio desempenha um papel fisiológico importante nos fenômenos que levam à aterosclerose , na qual descreveu-se um aumento nos níveis séricos de cálcio associado a uma diminuição nos níveis séricos de magnésio . Apesar da suplementação de magnésio introduzida aos animais do grupo D , não obtivemos nenhuma melhora bioquímica ou morfológica , provavelmente devido a interferência do EDTA no balanço entre outros oligoelementos , ou à liberação do ferro ligado à ferritina , resultante da fraca capacidade de ligação da estrutura da  molécula do EDTA aos metais . O dados obtidos reforçam a hipótese de participação de radicais livres na fisiopatologia da doença aterosclerótica e sugerem que a participação dos metais de transição na produção de radicais livres não seja a via bioquímica mais importante , ou que a depleção de minerais causada pelo EDTA possa neutralizar qualquer eventual efeito benéfico deste tipo de terapia . 

Tabela 1

Valores médios de Colesterol Total (mg/dl) , MDA (ng/ml) e da área lesões ateroscleróticas da superfície da artéria aorta (%Lesão).

GRUPO                              COLESTEROL                            MDA                         %LESÃO

                                                   (mg/ml)                                  (ng/ml)
A (N=07)                                 64  ±  32                               411 ±   51                              0
B (N=09)                                1577 ± 553                             1004 ± 200                 34,8 ± 5,7 *
C (N=10)                                1580 ± 487*                           1017 ± 143*               31,5 ± 7,7 *
D (N=08)                                1720 ± 265*                           1082 ± 279*               32,6 ± 4,8 *
* = p<0,001

Tabela 2

Valores médios de triglicérides (ng/ml) , HDL – colesterol (ng/ml) e LDL – colesterol (ng/ml) para os animais dos três grupos .

GRUPO                 TRIGLICERIDE              LDL-COLESTEROL         HDL-COLESTEROL

                                   (mg/ml)                                   (mg/ml)                                          (mg/ml)
A (N=07)                    134 ± 145                               17 ±18                                    24,0  ± 11,4
B (N=09)                    247 ± 154NS                      1513 ± 551*                               14,9 ± 4,3 +
C (N=10)                    202 ± 110NS                      1513 ± 470*                               13,9 ± 4,9 +
D (N=08)                    226 ±  45NS                       1522 ± 502*                               14,2 ± 6,1 +

NS =            Não Significante ; * = p<0,001 ; +                 =          p<0,05

Referência Bibliográficas

• Luz, P.L. – Aterosclerose : aspectos atuais . Atheros , 4(1):14-17, 1993.
• Assman, G.; Schulte, H. – Relation of high-density lipoprotein cholesterol and triglycerides to incidence of atherosclerotic coronary artery disease (The PROCAM experience ). Am . J. Cardiol., 70:733-7, 1992.
• Badimon, J.J.; Badimon, L. ; Fuster, V. – Regression of atherosclerosis Lesions by High Density Lipoprotein Plasma Fraction in the Colesterol- Fed Rabbit . The American Society for Clinical Investigation Inc., 85:1234-41, 1990.
• Cotran, R.S. ; Munro, M.- Pathogenesis of Atherosclerosis : Recent Concepts .In  : Grundy, S.M. & Bearn, A.G. – The Role of Cholesterol in Atherosclerosis . Hanley & Belfur, Philadelphia, .p.5-21.; 1987.
• Gey, K.F. – On the Antioxidant Hyphotesis with Regard to Atherosclerosis . Biblthca Nutr. Dieta , 37:53-91, 1986.
• Steinberg, D. ; Workshop Participants- Antioxidants in the Prevention of Human Atherosclerosis. Circulation , 85(6):2337-44, 1992.
• Estebauer, H.; Gebick, J.; Puhl, H.; Jurgens, G. – The Role of Lipid Peroxidation and Antioxidants in Oxidative Modification of LDL. Free Radical Biology & Medicine , 13:341-90, 1992.
• Martinez, T.L.R.; Percario, S.; Ihara, S.; Lopes, I.L.; Felippe Jr., J.; Portugal, O.P.; Martinez, E.E.F.; Badimon, J. – Major Impact of Probucol and its Antioxidant Effect on Regression of Experimental  Atherosclerotic Lesions . 3 rd Internacional Conference on Preventive Cardiology, 27 June-1 July , Oslo, Norway, 1993.
• Fani,K.; Debons, A.F.; Jimenez, F.A.; Hoover, E.L.- Cholesterol – Induced Atherosclerosis in the Rabbit : Effect of Dimethyl Sulfoxide on Existing Lesions. The Journal of  Pharmacology and Experimental Therapeutics, 244(3):1145-9, 1987.
• Percario, S. – Dosagem das LDLs modificadas através da peroxidação lipídica : correlação com risco aterogênico Anais Médicos dos Hospitais e da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo , 13(49-52):7-9, 1993.
• Felippe, Jr., J.; Percario, S. – Radicais Livres em Medicina Intensiva . Rev. Bras. Terap. Int., 3(3):66-72, 1991.
• Percario, S.; Ihara, S.; Martinez, T.L.R.; Felippe Jr., J. – Regression of Experimental Atherosclerosis in Rabbits by Using na Antioxidant . International Conference on Critical Aspects of Free Radical in Chemistry, Biochemistry and Medicine . Vienna, Austria , 14-17 th february , Book of abstracts , p 79 , 1993.
• Constantinides, P.; Booth, M.D.; Carlson,G. – Production of Advanced Cholesterol Atherosclerosis in the Rabbit. Arch. Pathol., 70:712-24, 1960.
• Holman, R.L.; Mc Gill, H.C.; Strong, J.P.; Geer, J.C.;- Technics for Studyind Atherosclerotic Lesions . Lab. Invest., 7:42-7, 1958.
• Satoh, K.- Serum lipid peroxide in cerebrovascular disorders determined by a new colorimetric method . Clin. Chim. Acta, 90:37-43, 1978.
• Yagi, K. – A simple Fluorometric assay for lipoperoxides in blood plasma . Biochem. Med., 15:212-6, 1976.
• Conti, M.; Morand, P.C.; Levillain, P.; Lemonnier, A. – Improved fluorometric determination of malonaldehyde. Clin. Chem., 377:1273-5, 1991.
• Percario, S.; Camargo, C.X.; Felippe Jr., J.- Avaliação dos radicais livres pela dosagem da peroxidação lipídica : padronização da técnica . Congresso Brasileiro de Clínica Médica II, São Paulo , Brasil, 25 a 29 setembro, Livro de abstracts, p.116. , 1993.