José de Felippe Junior

“Na arte de curar, deixar de aprender é omitir socorro e retardar tratamentos esperando maiores evidências científicas é ser cientista e não médico”
                                                                      JFJ                  
                       
“Em primeiro lugar sempre a Medicina Convencional”                                                                                                                       JFJ

“Se a Medicina Convencional não surtiu os efeitos desejados temos o direito e o dever como médicos de  utilizar os recursos da Medicina Complementar”
                                                                       JFJ

“Nunca devemos trocar uma Medicina pela Outra podemos sim complementá-la com Estratégias bem estudadas da Medicina Complementar”
                                                                      JFJ

“Na verdade a MEDICINA é uma só”
                                   Vários Autores

“É do médico a responsabilidade do paciente”
                                    Convenção de Helsinque

“Curar muitas vezes, aliviar e consolar sempre, desistir nunca”
                                   Médicos Humanos

“Se toda a medicina não está na bondade, menos vale dela separada”
                                   Miguel Couto

O amiloride é usado em clínica há muitos anos pelo seu efeito diurético e sabe-se que ele provoca acidificação do meio intracelular por interferência no crucial mecanismo de regulação celular do pH. Ele é um potente inibidor da bomba de Na+ / H+  da membrana celular , não permitindo a saída do próton H+ provocando desta forma a queda do pH citoplasmático. O amiloride  é a 3,5 diamino-6-cloro-N-(diamino-metileno) e sua ação se faz em todas membranas de mamíferos, não possuindo efeitos colaterais importantes (Benos – 1997 , Garty - 1997).
A membrana celular da maioria dos vertebrados contém um sistema de transporte trans-membrana que troca sódio por hidrogênio, na proporção estequiométrica de 1:1.  Esta bomba de Na+ / H+ desempenha papel fisiológico no controle da regulação do pH intracelular, no controle do crescimento e da proliferação celular, no estímulo-resposta dos leucócitos e plaquetas, na resposta metabólica a hormônios como a insulina e os glucocorticoides, na regulação do volume celular e na absorção e secreção trans-epitelial de íons sódio, hidrogênio, bicarbonato e cloreto e anions orgânicos. Alterações deste mecanismo de controle desempenham importante papel pato-fisiológico em diversas condições, como: hipertensão essencial, câncer e hipertrofia de tecidos e órgãos (Mahnebsmith – 1985).
O início da proliferação celular por indução da mitose geralmente é precedido pela alcalinização do citoplasma usualmente desencadeada pela estimulação dos canais de Na+ / H+ (Tannock -1989).
Desde 1992 sabe-se que a regressão espontânea de alguns tipos de câncer se deve ao aumento da acidificação do meio intracelular provocado por vários fatores entre eles o bloqueio da bomba de sódio / hidrogênio (Harguindey -1992). O amiloride acidificando o meio intracelular poderia impedir a proliferação celular.
De fato, a maioria das células malignas funciona com a energia proveniente da glicólise anaeróbia, que gera grandes quantidades de ácido lático e acidifica o meio intracelular. O meio ácido inibe as enzimas da glicólise, motor da mitose, e assim como mecanismo de sobrevivência as células malignas aumentam a expressão de elementos que facilitam o fluxo de prótons H+ para fora das células. Um destes elementos é a bomba Na+ / H+ e deste modo ocorre aumento da expressão desta bomba extrusora de prótons  na membrana celular das células malignas (Barriere-2001). No final teremos a normalização do pH intracelular e acidificação do meio intersticial que banha as células neoplásicas. De fato, o pH extracelular dos tumores é cerca de 0.5 unidade de pH inferior ao correspondente tecido não neoplásico (Yamagata-1996).
Juntamente com o aumento da expressão da bomba Na+ / H+ acontece outro mecanismo de sobrevivência celular : aumento da atividade da Akt, proteína que protege a célula da apoptose (Wu-2004).
Quando ocorre aumento da atividade da Akt observamos : 1-  bloqueio da citotoxicidade do TRAIL (Chen-2001 , Thakkar-2001) e 2- aumento da atividade de fator nuclear primordial na sobrevivência das células malignas, o NF-kappaB (Ozes-1999).
O amiloride além de inibir a bomba Na+ / H+ acidificando o meio intracelular e inibindo as enzimas da glicólise, inibe a atividade da Akt  o que permite a citotoxicidade induzida pelo TRAIL  que é o “ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF  ou “Tumor necrosis factor –Related Apoptosis –Inducing Ligand” .
O TRAIL é membro da família das citocinas do TNF, isto é, dos genes dos fatores de necrose tumoral. Atualmente o TRAIL é considerado arma muito promissora no combate ao câncer devido sua habilidade de induzir apoptose seletiva das células malignas.                                                       
            O TRAIL é capaz de induzir apoptose em grande variedade de células cancerosas em cultura sem provocar apoptose das células normais (Wiley -1995).   
Os receptores indutores de apoptose do TRAIL incluem os receptores trans-membrana tipo-I, TRAIL-R1 ou (DR4) e TRAIL-R2 ou (DR5). Esses receptores são expressos na superfície de muitas células tumorais sendo capazes de transmitir sinais apoptóticos via receptores do citoplasma (DISC). Entretanto o TRAIL também se liga a receptores de não-apoptose, DcR1 e DcR2, que possuem a capacidade de deletar a sua função apoptótica (Pan-1997).
A ligação do TRAIL a receptores do citoplasma forma o DISC “death-inducing signaling complex” com a subseqüente ativação da caspase-8 a qual ativa diretamente as caspases 3, 6 e 7 (Cohen-1997). A caspase-8 também cliva o Bid (p22) e forma o Bid (p15), o qual se transloca do citosol para a membrana mitocondrial liberando o citocromo-c (Li-1998). O citocromo-c agora no citoplasma interage com a Apaf-1 e a procaspase-9 formando na presença de ATP um “apoptosoma” que ativa a caspase-9. A caspase-9  ativa a protease caspase-3 a qual ativa a DNAase que cliva o DNA e provoca a apoptose.
A serina/treonina kinase Akt que funciona com proto-oncogene participa na manutenção de fatores de crescimento de sobrevida celular e previne a morte das células malignas por apoptose (Bellacosa – 1991). O aumento da atividade da Akt leva ao aumento da fosforilação e inativação da apoptose associada a proteínas como Bad, caspase-9 e fator de transcrição “forkhead” (Cross-2000).
A Akt também está envolvida na fosforilação do IkB kinase com o conseqüente aumento do NF-kappaB levando à indução de genes antiapoptóticos e aumento da superoxido dismutase, potente enzima antioxidante e portanto proliferativa (Ozes- 1999).
O HER-2/neu também conhecido como erbB2 é um gene do receptor da família do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que possui na membrana a enzima tirosina kinase. O aumento da expressão do erbB2 impede o efeito apoptótico do TRAIL. O amiloride defosforila a tirosina kinase do erbB2 e permite que o TRAIL promova a apoptose

As ações do amiloride são :

1. Inibe a bomba Na+ / H+   (Zhuang-1984 , Mahnensmith -1985)
2. Inibe a bomba Na+ / Ca++  (Smith-1982)
3. Inibe a bomba (Na+-K+) – ATPase  (Soltoff-1983)
4. Inibe a atividade da serina kinase  (Ralph-1982)
5. Inibe a atividade da tirosina kinase dos receptores de fatores de crescimento - EGFR (Davis-1985).
6. Inibe a atividade da Akt - proteína anti apoptótica (Kim-2005 , Cho-2004).
7. Aumenta a sensibilidade das células malignas à hipertermia  (Miyakoshi – 1986).
8. Inibe a termotolerância das células malignas (Kim – 1991)
9. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL ativando as caspases 3, 8 e 9 e ativando a PARP - poli(ADP-ribose) polimerase (Kim-2005).
10. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL aumentando a liberação do citocromo-c mitocondrial (Cho-2004).
11. Aumenta a ação do TRAIL na indução de apoptose no adenocarcinoma prostático andrógeno independente (Kim-2005).
12. Aumenta a ação do TRAIL no adenocarcinoma de próstata resistente – em linhagem andrógena dependente, células LNCaP (Kim-2005). Esta linhagem expressa altos níveis de HER-2/neu.
13. Aumenta a ação do TRAIL no adenocarcinoma de ovário – linhagem, SK-OV-3 (Kim-2005) . Esta linhagem expressa altos níveis de HER-2/neu

Câncer de próstata e de ovário
Nas células LNCaP do câncer de próstata existe aumento constitutivo da atividade da Akt o que confere resistência à apoptose via TRAIL. Cho em 2004 mostrou que neste câncer, o amiloride inibindo a bomba Na+/H+ e acidificando o meio intracelular inibe a Akt e ativa a caspase-8 , fatores que ativam o TRAIL e provocam drástica morte celular maligna por apoptose. 
As linhagens de adenocarcinoma LNCaP do câncer de próstata e SK-OV-3 do câncer de ovário as quais expressam altos níveis de erbB2 e aumento de ativação da Akt são pouco sensíveis ao TRAIL (Nesterov-2001 , Li-2004). O TRAIL sozinho não possui efeito nestas linhagens, porém na presença do amiloride, o qual diminui a erbB2 e a Akt,  o TRAIL promove a ativação das caspases 3 , 8 e 9 e a clivagem do DNA pelo PARP ,poli(ADP-ribose) polimerase, provocando a apoptose maligna (Kim-2005).
Cuello em 2001 mostrou que o tratamento com “Herceptin” – trastuzamab – promove a queda da proteína erbB2 e a inibição da atividade da Akt o que aumenta o efeito do TRAIL na indução de apoptose. Kim em 2005  mostrou que o amiloride possui efeitos semelhantes à droga de alto custo“Herceptin” provocando tanto a queda do erbB2 como a inibição da atividade da Akt.
            Alguns pesquisadores entre eles Kim, Lee e Song crêem que o amiloride causa diminuição da fosforilação do Akt inibindo a PI3K (fosfatidilinositol - 3 - kinase) e inibindo a PDK-1 kinase (fosfoinositide-dependente-kinase) assim como provocando a ativação da PP1 (fosfatase protéica 1) . O amiloride defosforila e ativa a PP1 o que indiretamente inativa a Akt e diretamente defosforila e inativa a Akt. Entretanto Cho , Nesmkoong e Han acreditam que seja a acidificação intracelular que provoca  a inativação da Akt.
           
            Câncer de próstata e ativadores do plasminogênio
            Sabe-se que alguns tumores de próstata refratários ao tratamento habitual apresentam altos níveis de ativadores do plasminogênio do tipo urokinase (uPA) e que o amiloride, um inibidor da uPa, reduz a invasividade da linhagem PC-3 do câncer de próstata humano (in Helenius-2006).
Foram analisados sessenta  e três tumores de próstata com recorrência local e refratários ao tratamento hormonal e 78 metástases de tumores de próstata humanos hormônio-refratário. Nos tumores com recorrência local, 21% apresentavam aumento de uPA e nas metástases o uPA estava elevado em 31% dos casos. Esses resultados indicam possível efeito terapêutico dos inibidores de uPA , como o amiloride no câncer de próstata (Helenius-2006).

Câncer de pâncreas
O carcinoma de pâncreas expressa altos níveis de ativador do plasminogênio do tipo urokinase (uPA) e seu receptor (uPAR), sendo que ambos promovem a migração e a invasão celular maligna. No camundongo com câncer de pâncreas a inibição da uPA/uPAR com amiloride  inibiu o fator de crescimento dependente de insulina (IGF-I) e a migração e invasão celular para o retroperitôneo (Bauer-2005) o que pode fazer do amiloride mais uma estratégia no tratamento do câncer de pâncreas.

Câncer colo-retal
Bauer no mesmo ano de 2005 continuou estudando os efeitos do amiloride agora em células do câncer colo-retal. Tais células expressam o receptor do IGF-I , o IGF-IR ; o receptor do c-Met e o receptor do uPA, o uPAR (receptor do ativador do plasminogênio tipo-urokinase) 3 conhecidos elementos que aumentam a migração e a invasão tumoral. A inibição do uPA/uPAR pelo amiloride bloqueia o efeito do IGF-I , do HGF (fator de crescimento do hepatócito) e do c-Met o que diminui a invasividade e a migração celular maligna.                                   

Câncer de cérebro - Glioblastoma multiforme
            Gliomas são tumores malignos do cérebro de alta complexidade e muito invasivos. Gliomas de alto grau possuem alto fluxo de Na+ para dentro da célula, independente de voltagem e amiloride-dependente, isto é, dependente do canal de Na+ / H+. Desta forma este fluxo pode ser impedido pelo amiloride. Este fluxo intracelular de sódio não existe na glia normal ou nos gliomas de baixo grau. A inibição deste fluxo diminui o crescimento tumoral e a invasividade do tumor (Bubien – 1999).
É bem conhecido o papel do sódio intracelular ativando os mecanismos de proliferação celular - mecanismo antigo de sobrevivência celular ( Felippe –maio de 2003).
            Os canais sensíveis a íons ácidos (ASICs) são membros da família do canal epitelial de Na+ (ENaC) / degenerina (DEG) são  os ENaC / DEG .
            Vila-Carriles em 2006 mostrou que a inibição do canal ASIC tipo 2 com
chaperones (heat shock proteins), glicerol ou 4-fenilbutirato  inibe a corrente de sódio para dentro das células inibindo o crescimento do glioma de alto grau (glioblastoma multiforme). Estes canais também são inibidos pelo amiloride. As “heat shock” proteínas são geradas durante a hipertermia , uma das terapias do câncer.
           

As principais ações do amiloride são :

1. Inibe a bomba Na+ / H+  aumentando a acidificação citoplasmática e inibindo várias enzimas da glicólise anaeróbia (motor da mitose).
2. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL ativando as caspases 3, 6, 7, 8 e 9

TRAIL – “Tumor necrosis factor –Related Apoptosis –Inducing Ligand”

1. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL ativando a PARP - poli(ADP-ribose) polimerase
2. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL aumentando a liberação do citocromo-c mitocondrial
3. Aumenta a ação apoptótica do TRAIL inibindo a atividade da proteína Akt
4. Inibe a atividade da serina kinase 
5. Inibe a atividade da tirosina kinase dos receptores da família EGFR de fatores de crescimento
6. Inibe a atividade da Akt – potente proteína antiapoptótica e geradora de NF-kappaB
7. Aumenta a ação do TRAIL na indução de apoptose no adenocarcinoma prostático andrógeno independente.
8. Aumenta a ação do TRAIL na indução de apoptose no adenocarcinoma de próstata resistente – em linhagem andrógena dependente, células LNCaP que expressam altos níveis do gene HER-2/neu (erbB2) e ativação da proteína Akt.
9. Aumenta a ação do TRAIL na indução de apoptose no adenocarcinoma de ovário – linhagem, SK-OV-3 que expressa altos níveis do gene HER-2/neu (erbB2) e ativação da proteína Akt.
10. Possui efeito semelhante ao “Herceptin” promovendo a queda do erbB2 e diminuição da atividade da Akt o que provoca aumento drástico da apoptose pelo TRAIL
11.  Inibe o uPA / uPAR , ativador do plasminogênio do tipo urokinase e seu receptor, inibindo a invasividade e a metástase
12.  Inibe o IGF-I e IGF-IR
13.  Inibe o GHF fator de crescimento do hepatócito
14.  Inibe o c-Met diminui a migração e invasão
15. Aumenta a sensibilidade das células malignas à hipertermia
16. Inibe a termotolerância das células malignas
17. Inibe a bomba Na+ / Ca++ 
18. Inibe a bomba (Na+-K+) – ATPase 

Conclusão
            O amiloride acidifica o meio intracelular neoplásico, inibe a proteína Akt, diminui a expressão do gene erbB2 e ativa o TRAIL fatores que dificultam a proliferação celular e provocam aumento drástico da apoptose. Além disso ele inibe o ativador do plasminogênio do tipo uroquinase diminuindo a invasão tumoral local e as metástases.
            Sendo droga órfã de pai e mãe e portanto não patenteável não esperamos no futuro, trabalhos de grande casuística. O que teremos são alguns estudos pequenos feitos por médicos que se preocupam em tratar o melhor possível os seus pacientes, quando já cessaram as armas da nossa querida medicina convencional.    

Não vamos desistir desta luta
                                              

No mundo não há fracassados e sim desistentes
                                                           Confucio

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