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Tratamento do câncer com medidas e drogas que acordam genes silenciados pela metilação das ilhas CpG do DNA Dr. Jose de Felippe Junior Introdução | Reativação de genes silenciados | Bibliografia
A recente explosão em nosso conhecimento de como a organização da cromatina modula a transcrição dos genes clareou a importância dos mecanismos epigenéticos da iniciação e progressão do câncer. Essas alterações epigenéticas afetam cada etapa da progressão do tumor e em particular a hipermetilação aberrante das regiões promotoras CpG, está associada com o inapropriado silêncio transcricional de genes supressores do câncer.
Nos últimos 15 anos , Greger, Jones, Baylin, Esteller e outros , têm demonstrado como fator comum do câncer humano o silêncio transcricional de genes supressores de tumor, tais como o p16 INK4a , hMLH1 , BRCA1 , associado com a hipermetilação das ilhas CpG localizadas na região promotora desses genes.
Foi Greger em 1989 que primeiro descobriu a metilação de uma ilha CpG de um gene supressor do câncer humano, o gene retinoblastoma ( Rb ) . Entretanto , somente em 1994, surgiu a idéia que a hipermetilação da região promotora da ilha CpG, poderia ser um mecanismo inativador de genes no câncer. A origem de uma verdadeira explosão de conhecimentos sobre eventos epigenéticos no câncer aconteceu no laboratório de Stephen Baylin e Peter Jones. Esses pioneiros descobriram que a hipermetilação da citocina nas ilhas CpG , é um mecanismo de inativação do gene p16 INK4a , gene supressor de tumor no câncer humano.
A hipermetilação da citocina nas ilhas CpG localizadas nas regiões promotoras dos genes supressores de tumor , é considerada atualmente como importante mecânismo de inativação de genes.
Embora exista diferenças, dependendo do tipo de tumor, todas as neoplasias humanas possuem múltiplos genes supressores de tumor afetando diferentes vias celulares , que são simultâneamente inativadas no mesmo tumor e que contribuem para o fenótipo neoplásico.
A hipermetilação da ilha CpG foi descrita em quase todos os tipos de tumores e muitas vias celulares são inativadas por esse tipo de lesão epigenética :
Reparação de DNA ( hMLH1 , MGMT )
Ciclo celular ( p16 INK4a , p15 INK4b , p14 ARF )
Apoptose ( DAPK )
Aderência celular ( CDH1 , CDH13 )
Desintoxicação ( GSTP1 ) , etc...
A hipermetilação não é um evento isolado do controle epigenético, estando ligada a outras peças do quebra cabeças tais como: proteinas com ligações metil, DNA metiltransferases e histona desacetilase.
Sabemos pouco sobre os mecanismos de metilação aberrante e porque certos genes são silenciados e outros não. Existe uma lista enorme de genes que são inativados por metilação aberrante das ilhas CpG. A grande maioria dessas ilhas, entretanto, estão completamente não metiladas nos tecidos normais e portanto funcionantes.
No genoma dos mamíferos a metilação ocorre somente nas bases citosina que estão localizadas próximas das bases guanosina de um dinucleotideo CpG. A maioria das ilhas CpG estão localizadas na região promotora de metade dos genes do genoma dos mamíferos e estão geralmente não metiladas nas células normais, como já escrevemos . Entretanto, no câncer a hipermetilação destas regiões promotoras é a alteração epigenética mais importante e mais frequente, ocorrendo em praticamente todos os tipos de neoplasias malignas humanas. A hipermetilação da região promotora, está associada com o silêncio transcricional inapropriado dos genes supressores do tumor e para muitos autores é o único mecanismo de perda da função de muitos genes nos tumores malignos.
A metilação da citosina é um evento catalizado pela DNA(citosina-5) metiltransferase, um grupo de várias enzimas correlacionadas. A S-adenosil-metionina serve como doadora de radicais metila nas reações de transmetilação e a transmetilação é competitivamente inibida pela S-adenosil-homocisteina. A metilação do DNA também pode ser inibida por inibidores não específicos das reações de transmetilação como a `` metinin`` .
Seqüências de DNA hipometilado se correlacionam com a expressão gênica e as seqüências de DNA metilado se correlacionam com a supressão gênica.
Nos últimos anos tornou-se evidente que a metilação aberrante das regiões promotoras está associada com a perda de função dos genes supressores de tumor, o que proporciona vantagens para as células neoplásicas (mecanismo epigenético) , da mesma forma que as mutações também trazem vantagens para elas ( mecanismo genético) .
Diferente dos eventos mutagênicos, os eventos epigenéticos no câncer podem ser revertidos, restaurando assim a função das vias de controle chave das células malignas e pré-malignas, podendo diminuir a proliferação celular neoplásica.
Reativação de genes silenciados
O achado de que muitos genes controladores da homeostase celular podem ser silenciados inapropriadamente no câncer, por alterações estruturais da cromatina envolvendo a metilação do DNA, encorajou os pesquisadores a procurar agentes para reverter este processo e assim restaurar as vias sinalizadoras principais das células.
A liberação da repressão de genes supressores de tumor e dos genes do ciclo celular provoca a inibição do crescimento tumoral.
Muitos autores acreditam que os agentes demetilantes podem reativar genes silenciados também nas células normais, porém, sabe-se muito pouco sobre o espectro de genes que seriam atingidos.
É digno ressaltar que a retirada do agente demetilante , pode provocar a ``de novo-metilação`` e o re-silenciamento do gene alvo. Esta ``de novo-metilação`` das ilhas CpG ocorre na fase precoce da carcinogênese e muito interessante ,pode ser detectada no epitélio normal de pacientes como um processo associado ao envelhecimento ou à inflamação.
O alvo dos agentes demetilantes são as ilhas CpG da região promotora do DNA, com a finalidade de ``acordar `` os genes supressores de tumor silenciados pela metilação.
Agentes demetilantes no câncer:
Os meios de se interferir com a metilação do DNA são:
inibição da atividade das enzimas DNA metiltransferases ;
diminuição do pool intracelular de S-adenosil-metionina ;
aumento do inibidor competitivo, S- adenosil-homocisteina ou 4- indução de inibidores não específicos das DNA metiltransferases.
a - 5-azaCitidina :
Este nucleosídeo é um poderoso inibidor da metilação do DNA e já se demonstrou que funciona como um agente anti câncer. Ele é incorporado nos ácidos nucleicos das células em divisão onde inibem as metiltransferases do DNA.
Os análogos dos aza-nucleotideos, cujo protótipo é a 5-azaCitidina, são instáveis em solução aquosa e provocam efeitos colaterais sérios como a mielosupressão, em altas doses. Parece que baixas doses são tão eficazes ou até mais eficazes.
Este grupo de agentes demetilantes são sinérgicos com deacetilantes de histonas , substâncias que também funcionam ``acordando`` genes silenciados.
Rhee e Bachman em 2002, observaram uma drástica redução do crescimento tumoral em células do câncer colo-retal, pela inibição das DNA metiltransferases, levando à demetilação e reativação do gene inibidor do ciclo celular , o gene p16 INK4a .
Os nucleosídeos provocam efeitos colaterais nos seres humanos, tais como, trombocitopenia e neutropenia , por efeito citotóxico associado com a incorporação da droga no DNA, independentemente do seu efeito hipometilante.
b- Procainamida
Em 1988, Cornacchia e em 1991 Scheinbart, assinalam a procainamida como um inibidor não nucleosídeo da metilação do DNA.
A procainamida , muito usada como antiarrítmico cardíaco em passado recente, é um inibidor não competitivo das enzimas metiltransferases do DNA e já se comprovou seu efeito na reativação da transcrição do gene p16 INK4a em células do câncer de próstata humano, implantado em camundongo .
Em 1991, Lee Scheinbart, escreve artigo discorrendo pela primeira vez , sobre o papel da procainamida em inibir a metiltransferase do DNA. Em seu estudo utilizou linhagem de células de leucemia humana ( T cell Jurkat ).
O autor mostrou que a procainamida inibe a DNA metiltranferase em concentrações baixissímas, da ordem de 10 -7 a 10 -10 Molar ``in vitro`` . Na prática clínica a procainamida em doses habituais atinge a concentração de 10 -5 Molar , sugerindo que inibição semelhante também esteja ocorrendo ``in vivo``.
Scheinbart , mostrou que a procainamida inibe a DNA metiltransferse de um modo reversível e que ela não afeta os níveis intracelulares de S-adenosil-metionina , de S-adenosil-homocisteina. ou de substâncias inibidoras inespecíficas.
Conhecemos outra hipótese sobre o mecanismo de ação da procainamida que poderia envolver o seu efeito sobre a membrana celular. A procainamida altera a despolarização da membrana sendo possível que essa alteração acarretaria a hipometilação do DNA
O câncer de próstata humano caracteristicamente contém ilhas CpG hipermetiladas abrangendo a região transcricional reguladora do GSTP1, o gene codificado para a classe-pi de glutationa S-transferase ( GSTP1) , e falha em expressar a GSTP1 por apresentar hipermetilação da ilha CpG, a alteração somática do genoma mais comum do câncer de próstata humano. Ela ocorre nos estágios precoces da carcinogênese prostática humana e resulta na perda da função protetora do GSTP1, deixando as células prostáticas com defesa inadequada contra os agentes carcinogênicos oxidantes e eletrofílicos. Lin em 2001 , mostra que a procainamida , reverte a hipermetilação da ilha CpG do GSTP1 e restaura a expressão do GSTP1 na linhagem de câncer de próstata LNCaP tanto ``in vitro`` como ``in vivo``.
c- Procaina
A procaina e a procainamida são derivados do ácido 4-aminobenzoico ; a primeira é um éster com o 2-(dietilamino) etanol e a segunda é uma amida com o 2-(dietilamino) etilamina. Esse compostos são semelhantes, porém possuem ações distintas em suas interações com proteinas, DNA e outras biomoleculas.
Em 2001, Lin e Asgari, demonstram que a procaina provoca hipometilação global do DNA e restaura a expressão do gene detoxicante GSTP1 em células do câncer de próstata, que haviam sido silenciados por hipermetilação.
Em 2003 a pesquisadora Ana Villar – Garea , prova que a procaina é um agente demetilante do DNA com efeito inibitório sobre o crescimento de células cancerosas humanas.
Villar - Garea, testou a procaina em células do câncer de mama humano (MCF – 7) constatando que tal agente demetilante de DNA , provoca 40% de redução da 5-metilcitosina das ilhas CpG do DNA. Essa conclusão foi alcançada empregando 3 tipos diferentes de metodologia : HPLC , eletroforese e digestão enzimática total do DNA.
A procaina , também pode demetilar as ilhas CpG densamente hipermetiladas , como aquelas localizadas na região promotora do gene RARbeta2, restaurando a expressão gênica de genes epigeneticamente silenciados . Esta propriedade pode ser explicada pelos achados da pesquisadora , de que a procaina liga-se fortemente ao DNA rico em CpG.
Finalmente a autora demonstrou que a procaina suprime o crescimento das células do câncer de mama humano simultâneamente com a ocorrência dos eventos demetilantes.
A procaina possui efeitos inibitórios do crescimento nas células do câncer de mama associado com a parada do ciclo celular, na fase M da mitose. Não foi observado apoptose, neste tipo de experimento , com a técnica empregada ( técnica do TUNEL ).
A procaina pára o crescimento das células neoplásicas ``in vitro`` , fato que pode explicar a razão da procaina aumentar a atividade antitumoral de vários quimioterápicos convencionais, como a cisplatina, mitomicina C, peplomicina e doxorubicin .
A procaina aumenta a sensibilidade das células neoplásicas à radioterapia e também aumenta a morte de tais células quando submetidas à hipertermia.
A procaina não é incorporada, ela apenas liga-se ao DNA, o que faz desta droga um exemplo de agente que demetila o DNA e reativa genes metilados com muito menos efeitos tóxicos que os nucleosídeos, os quais são incorporados na molécula do DNA.
A dose de procaina que provoca demetilação e efeitos inibitórios sobre o crescimento maligno é da mesma ordem de grandeza que aquelas empregadas juntamente com a quimioterapia ou a radioterapia . Digno de se ressaltar : a procaina protege o indivíduo contra os efeitos nefrotóxicos e hepatotóxicos da quimioterapia e também aumenta a eficácia da radioterapia, enquanto protege as células normais dos seus efeitos ionizantes prejudiciais.
Em 1990, Mauro Esposito , médico italiano, ressalta que em camundongos, a procaina aumenta a eficácia da cisplatina em células leucêmicas P388 ``in vivo`` , tanto por via oral como por via intravenosa.
d- Hidralazina
Em 1988, Elizabeth Cornacchia ,mostra que a hidralazina e a procainamida inibem a metilação do DNA em linfocitos T. Tanto a hidralazina como a procainamida podem induzir o aparecimento de síndrome lupus-like e possivelmente a inibição de metilação do DNA induza a autoreatividade de linfocitos T produzindo assim a doença referida.
A 5-azaCitidina, a procainamida e a hidralazina, compartilham as propriedades de inibir a metilação do DNA e induzir a auto reatividade de linfocitos T humanos.
A hidralazina e a procainamida são menos eficazes em inibir a metilação da citosina , quando comparadas com a 5-azaCitidina. Seus efeitos se assemelham aos de outros inibidores da metilação do DNA , como os benzopirenos e a novobiocina .
A hidralazina possui também uma ação do tipo retardado , sugerindo que um de seus metabolitos também possua efeito inibidor da metilação.
As doses de hidralazina usadas em clínica , atingem níveis séricos de 0,5 a 5 microMol , o suficiente para apresentar os efeitos aqui descritos.
Descobriu-se recentemente uma conecção dinâmica entre dois processos epigenéticos no câncer, a demetilação do DNA e a desacetilação da histona , ambos envolvidos no silêncio da expressão de genes supressores do câncer.
Elizabeth Cameron em 1999, descreve um inibidor específico da histona desacetilase, a ``trichostatina`` ( TSA ) , a qual ``in vitro`` consegue reverter a expressão de genes silenciados. Sozinho o TSA não consegue supra-regular a expressão de genes metilados, entretanto após mínima demetilação e leve reativação gênica na presença de baixas doses de 5-aza-2deoxycitidine, o TSA provoca robusta re-expressão de cada gene
A interferência sobre os mecanismos epigenéticos do câncer abre imensas possibilidades de êxito terapêutico.
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